陳智慧¹ 史梅1      王秋香²       張曉紅²

(1.新疆維吾爾自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所 新疆 830063; 2.新疆農業(yè)大學 動物醫(yī)學學院 新疆 830052)

 

[摘 要]為了更加**的運用凱氏定氮法檢測分析食品中蛋白質的含量,本文分別用全量凱氏定氮法、微量凱氏定氮法和凱氏自動定氮儀來測定了食品中的蛋白質的含量,結果發(fā)現(xiàn)用兩種方法對同一樣品中的蛋白質含量得出數(shù)值高低不同,全量凱氏定氮法的結果更加**，微量法次之。

[關鍵詞]凱氏定氮法；**；含量；蛋白質

 

WangQiu-xiang     

Astract: In order to more precise use of Kjeldahlmethod of detecting the protein content in food, we were in fullvolume Kjeldahl, trace Kjeldahl law and Kay's automatic instrumentto measure the nitrogen in food protein The content, and found twoways of the same protein content in the samples drawn high and lowvalues, all of Kjeldahl method more accurate results. Trace oftimes.

Key words: Kjeldahl; accurate; content offood，Protein

 

 

 

前言

測定蛋白質的方法可分為兩大類：一類是利用蛋白質的物理化學性質來推算，如密度、折射率、紫外吸收、熒光性等；另一類是利用化學方法來計算，如定氮、雙縮脲反應、染料結合反應、酚試劑反應等

 主要測定方法有：雙縮脲法、染料結合法、酚試劑法、紫外分光光度法、水揚酸比色法、折光法、旋光法、近紅外光譜法.

目前蛋白質測定*常用的方法是凱氏定氮法，是通過測總氮量來確定蛋白質含量的方法。

 凱氏定氮法是通過測出樣品中的總含氮量再乘以相應的蛋白質系數(shù)而求出蛋白質的含量,此法的結果稱為粗蛋白質含量：由于樣品中含有少量非蛋白質含氮化合物，如核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白質的含氮化合物.凱氏定氮法是測定總有機氮量較為準確、操作較為簡單的方法之一，可用于所有動、植物食品的分析及各種加工食品的分析，可同時測定多個樣品，故國內外應用較為普遍，是個經(jīng)典分析方法^[6]。至今仍被作為標準檢驗方法.此法可應用于各類食品中蛋白質含量測定

凱氏定氮法可分為全量法、微量法及經(jīng)改進后的改良凱氏定氮法目前通常以硫酸銅作催化劑的常量、半微量、微量凱氏定氮法樣品質量及試劑用量較少，且有一套微量凱氏定氮器。在凱氏法改良中主要的問題是，氮化合物中氮的完全氨化問題及縮短時間、簡化操作的問題，即分解試樣所用的催化劑。常量改良凱氏定氮法在催化劑中增加了二氧化鈦^[4].

在理化實驗室,檢驗食品中蛋白質的含量通常用微量凱氏定氮法和全量凱氏定氮法.接下來以大量的試驗來比較微量凱氏定氮法和全量凱氏定氮法的**度的大小.

1.材料與方法：

1.1試驗材料

1.1.1試驗樣品

肉禽制品(牛肉、馬肉、葷餃子餡)

豆制品(豆腐乳)

調味品(雞精)

乳制品(純牛奶)

糕點(面包)

植物蛋白飲料(椰汁)

冷飲及冰制品(雪糕、冰激淋)

1.1.2試驗藥品和試劑

所有試劑均為分析純；水為蒸餾水或同等純度的水。

硫酸銅；

硫酸鉀；

濃硫酸；

40％氫氧化鈉溶液：稱取40g氫氧化鈉溶于60mL蒸餾水中；

4％硼酸溶液：稱取4g硼酸溶于蒸餾水中稀釋至lOOmL；

0．1mol／L鹽酸標準滴定溶液；

甲基紅次甲基藍混合指示液：將次甲基藍乙醇溶液(1g／L)與甲基紅乙醇溶液(1g／L)按1+2體積比混合。

1.1.3儀器和設備：

 實驗室常規(guī)儀器及下列各項：

凱氏燒瓶：500mL；

可調式電爐；蒸汽蒸餾裝置；

鉸肉機：

篦孔徑不超過4nm；

組織搗碎機；

粉碎機；

研缽：玻璃或瓷質；

化學消化器，

凱氏定氮儀，

空氣濾過器

1.2試驗方法

 1.2.1微量凱氏定氮法

微量凱氏定氮法的原理

    樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉化為氨與硫酸結合成硫酸銨。然后取消化液的1/10加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標準鹽酸或硫酸溶液滴定^[2]。根據(jù)標準酸消耗量可計算出蛋白質的含量。包括消化、蒸餾、吸收、滴定四個步驟

 1.2.2全量凱氏定氮法

全量凱氏定氮法的原理

    樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉化為氨與硫酸結合成硫酸銨。然后取消化液的全部加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標準鹽酸或硫酸溶液滴定。根據(jù)標準酸消耗量可計算出蛋白質的含量。包括消化、蒸餾、吸收、滴定四個步驟

2 分析過程

試樣制備：固體樣品：取有代表性的樣品至少200g，用研缽搗碎、研細；不易搗碎、研細的樣品應切(剪)成細粒；干固體樣品用粉碎機粉碎；液體樣品：取充分混勻的液體樣品至少200g。粉狀樣品：取有代表性的樣品至少200g(如粉粒較大也應用研缽研細)，混合均勻；糊狀樣品：取有代表性的樣品至少200g，混合均勻；固液體樣品：按固、液體比例，取有代表性的樣品至少200g，用組織搗碎機搗碎，混合均勻；肉制品：取去除不可食部分、具有代表性的樣品至少200g，用鉸肉機至少鉸兩次，混合均勻。上述試樣應放入密閉玻璃容器中，于4°C冰箱內貯存?zhèn)溆?，盡快測定。

2.1微量凱氏定氮法的分析過程

 2.1.1樣品消化 :

步驟：準確稱取一定量的樣品，加入硫酸銅0.5g、硫酸鉀10g和濃硫酸20mL、玻璃珠數(shù)?！⌒囊迫敫稍餄崈舻?00ml凱氏燒瓶中(固體或粉末用紙卷成紙筒送入)，輕輕搖勻，以45o斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上→用電爐以小火加熱(或先燒瓶放在距電爐較遠處)，待內容物全部炭化、泡沫停止產生后→加大火力(或將燒瓶放在電爐上)，保持瓶內液體微沸→至液體變藍綠色透明后→繼續(xù)加熱微沸30min→關閉電爐，取下燒瓶、冷卻→轉移至100ml容量瓶中，加水定容

  2.1.2 蒸餾與吸收：

  按圖安裝好微量定氮蒸餾裝置。于水蒸氣發(fā)生瓶內裝水至2/3容積處，加甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升，以保持水呈酸性，加入數(shù)粒玻璃珠。在接受瓶中加入10ml40g/L硼酸及2滴混合指示劑，將冷凝管下端插入液面以下。準確吸取消化液10mL于反應管內，經(jīng)漏斗再加入10mL氫氧化鈉溶液，用少量蒸餾水沖洗漏斗，夾好漏斗夾并水封，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內的水進行蒸餾。指示劑變綠色后繼續(xù)蒸餾10min，將冷凝管**提離液面繼續(xù)蒸1min

 

 

2.1.3  滴定

  將接受瓶內的硼酸液用0.01mol/L鹽酸標準溶液滴定至終點。同時做一試劑空白（除不加樣品，從消化開始操作完全相同）。

2.1.4  結果計算

 

 

式中    W—蛋白質的質量分數(shù)    %；

 

       c—鹽酸標準溶液的濃度，mol/L；

       V1—空白滴定消耗標準液量，mL；

         V2—試劑滴定消耗標準液量，mL；

         m—樣品質量，g；

      0.014—氮的毫摩爾質量，g/mmol；

           F—蛋白質系數(shù)。

幾類常見食物的蛋白換算系數(shù)如下

 

 

計算結果**至小數(shù)點后**位。

同一試樣做兩次平行試驗，同時做空白試驗。

2. 2全量凱氏定氮法的分析過程

2.2.1樣品消化 (同”微量法”)

2.2.2蒸餾與吸收

   安裝好全量定氮蒸餾裝置。于水蒸氣發(fā)生瓶內裝水至2/3容積處，加甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升，以保持水呈酸性，加入數(shù)粒玻璃珠。在接受瓶中加入40ml40g/L硼酸及3滴混合指示劑，將冷凝管下端插入液面以下。將全部消化液轉移于反應管內，加入125mL蒸餾水，搖勻后再加入40mL氫氧化鈉溶液，用少量蒸餾水沖洗漏斗，夾好漏斗夾并水封，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內的水進行蒸餾。指示劑變綠色后繼續(xù)蒸餾10min，將冷凝管**提離液面繼續(xù)蒸1min

2.2.3滴定：

同“微量法”。

2.2.4計算

 

2.3 自動凱氏定氮儀的分析過程

2.3.1樣品消化

 準確稱取一定量的樣品，加入硫酸銅0.5g、硫酸鉀10g和濃硫酸20mL、小心移人與化學反映器配套的消化管內,置于化學反映器上消化,同時打開空氣過濾器,預約消化溫度為410°C,預約時間為180分鐘.到達預約時間后,化學反映器自動停止加熱,冷卻至室溫

2.3.2蒸餾、吸收、滴定、計算

   打開凱氏定氮儀和冷凝水開關,檢查機器與試劑的連接是否完好,將樣品的

質量,和蛋白質系數(shù)輸入系統(tǒng),把裝有冷卻消化液的消化管連接在凱氏定氮儀上,按下”ENTER”鍵,約五分鐘后,打印出此樣品相關信息的屏條,將直接顯示    樣品中蛋白質的百分含量.

3.試驗結果和分析

通過實驗得到的蛋白質含量數(shù)據(jù)如下表：

 

 

分析：

微量凱氏定氮法所測定的樣品平行樣間平均差別為：0.1208

全量凱氏定氮法所測定的樣品平行樣間平均差別為：0.0353

微量凱氏定氮法的測定結果與自動定氮儀的平均差別為：0.7697

全量凱氏定氮法的測定結果與自動定氮儀的平均差別為：0.0523

4.討論

4.1通過比較傳統(tǒng)凱氏定氮法和凱氏自動定氮儀所測定出的食品的蛋白質含量可以看出,用傳統(tǒng)的凱氏定氮法所測定的蛋白質含量比凱氏自動定氮儀測出的結果偏低,前者兩次測定的同一食品的蛋白質含量差別較后者大,即樣品的平行性平行性不夠好,精密度不高..是由于在傳統(tǒng)定氮的過程中存在著樣品消化液的轉移,在轉移的過程中有誤差的存在,導致消化液的流失,從而測定的數(shù)據(jù)稍偏低.差別較大

4.2通過比較傳統(tǒng)凱氏定氮法中的微量凱氏定氮法和全量凱氏定氮法可以看出,后者的數(shù)據(jù)高于前者,精密度高于后者,是由于前者在實驗的過程中轉移的次數(shù)較多,誤差較大

4.3通過比較以上三組數(shù)據(jù)可以得知:凱氏定氮儀的的精密度*高,微量凱氏定氮法的*低;全量凱氏定氮法得到的數(shù)據(jù)和凱氏定氮儀的數(shù)據(jù)差別較小,準確度高.

4.4量取的樣品倒入凱氏燒瓶時，不要將樣品粘在瓶頸上，以免加入消化液后試樣炭化粘在瓶頸上消化不徹底．消化過程中要逐漸升溫，當?shù)蜏丶訙刂脸霈F(xiàn)帶有硫酸的白色氣體后，才可升溫使溶液沸騰，但應避免劇烈沸騰。

4.5．消化液加蒸餾水稀釋后，應及時蒸餾，否則應保存消化液，臨用時再加蒸餾水稀釋．反應室加入堿液后，應立即蓋塞并加水封，注意各接頭處的密封情況，防止漏氣。

4.6．蒸餾時，加入的氫氧化鈉溶液除與硫酸銨作用外，還與消化液中的硫酸和硫酸銅作用．若加入的氫氧化鈉不夠，則溶液呈藍色，不生成褐色的氫氧化銅沉淀．所以，加入的氫氧化鈉必須過量，并且動作還要迅速，以防止氨的流失。

4.7．蒸氣發(fā)生瓶內的水裝至三分之二體積并且保持酸性（在蒸氣發(fā)生瓶內的水中加入稀硫酸，使之呈酸性，內加甲基橙指示劑數(shù)滴，水應呈橙紅色，如變黃時，應該補加酸），以防止在堿性條件水中游離氨蒸出，使結果偏大。

4.8．因蒸餾時反應至外層的氣壓大于反應室內的壓力，而反應室的壓力大于大氣壓力，故可將氨帶出。所以，蒸餾時，蒸氣要發(fā)生均勻，充足，蒸餾中不得停火斷氣，否則，會發(fā)生倒吸。停止蒸餾時，由于反應室外層的壓力突然降低，可使液體倒吸入反應室外層，所以，操作時，應先將冷凝管下端提高液面并清洗管口，再蒸一分鐘后關掉熱源。蒸餾是否完全，可用精密ＰＨ試紙測冷凝管口的冷凝液來測定，中性則說明已蒸餾完全。

5結論

5.1由于凱氏定氮法的誤差，主要因消化操作的條件而產生，因此要格外注意

5.2全量凱氏定氮法的準確度和精密度比微量凱氏定氮法高,即**度高.

5.3凱氏自動定氮儀的誤差較傳統(tǒng)的凱氏定氮法小,精密度高,因而**度*高.

5.4 在實際的生產實驗中，凱氏定氮法作為一種國家標準，應該嚴格按照標準的分析試劑、用量及分析過程來操作

 

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